納米抗體（VHHs）因其可通過工程改造直接在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)而成為有吸引力的抗體形式。利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建的免疫羊駝VHH庫，并從中篩選得到抗Fc VHHs，它們可以與人類抗體Fc段高親和力地結(jié)合。當(dāng)用于標(biāo)記產(chǎn)生mAb的CHO細(xì)胞時，GFP融合的anti-human Fc VHH-GFP產(chǎn)生的FACS信號明顯強(qiáng)于AF488連接的抗IgG抗體。此外，基于抗Fc VHH-GFP標(biāo)記的CHO細(xì)胞的分選使高生產(chǎn)力的細(xì)胞系得以富集。相比傳統(tǒng)的動物來源熒光抗體，這種安全且具有成本效益的抗Fc VHH-GFP可用于優(yōu)化治療性mAb生產(chǎn)的高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選過程。
高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選和富集仍然是單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)過程中面臨的巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的有限稀釋法是成熟和可靠的，但它耗時長，而且通量低。因此，一種高效和高通量的篩選方法就更加重要了。近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，新型的單細(xì)胞篩選方法已經(jīng)被開發(fā)出來，以促進(jìn)更有效地分離高產(chǎn)的克隆細(xì)胞，如單細(xì)胞分析和分離系統(tǒng)，包括：
1）基于細(xì)胞表面顯示技術(shù)的無標(biāo)簽篩選方法，微流控技術(shù)和Beacon平臺；
2）利用ClonePix? Systems分析生長在半固體中的細(xì)胞，并通過克隆熒光顯微鏡進(jìn)行挑選。
研究結(jié)果表明，分泌的蛋白質(zhì)會被短暫截留在細(xì)胞表面，并且與細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)的量相關(guān)，這為使用流式細(xì)胞儀和細(xì)胞分選來分離出稀有的高產(chǎn)細(xì)胞提供了啟發(fā)。熒光激活細(xì)胞分選（FACS）根據(jù)測定的熒光水平對細(xì)胞進(jìn)行篩選，已被證明是高效且有效的。然而，在篩選過程中使用的抗IgG熒光抗體來自于動物源，導(dǎo)致人們對生物制藥生產(chǎn)中的生物安全性產(chǎn)生擔(dān)憂。因此，尋求一種重組抗體用于細(xì)胞標(biāo)記，并從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中選擇高產(chǎn)的亞克隆，顯得尤為重要。研究表明，單鏈可變片段（scFv）和綠色熒光蛋白（GFP）的融合抗體可以在流式細(xì)胞儀中直接標(biāo)記細(xì)胞，避免了抗原結(jié)合能力的喪失，減少了背景染色。與scFv相比，VHH在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、分子量、表達(dá)產(chǎn)量、DNA操作和文庫構(gòu)建的便利性方面具有更多優(yōu)勢。
利用VHH-GFP篩選出可高表達(dá)抗Her2 mAb的重組CHO細(xì)胞系。通過噬菌體展示技術(shù)篩選出抗Fc的VHH，以GFP融合標(biāo)簽的形式在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。純化后的VHH-GFP可用來標(biāo)記CHO細(xì)胞，并以熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)分離出高產(chǎn)細(xì)胞系。最后，檢測不同亞克隆中抗Her2 mAb的表達(dá)水平。通過與傳統(tǒng)的熒光抗體（Goat anti-human IgG(H+L) antibody, Alexa Fluor 488）的對比，評估VHH-GFP在分選高產(chǎn)細(xì)胞系的可行性。
用F. sight分別對VHH-1-GFP或AF488標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分選。VHH-1-GFP標(biāo)記（圖1，B）的細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度明顯高于AF488標(biāo)記的傳統(tǒng)抗體（圖1A）的熒光強(qiáng)度。單個細(xì)胞系的熒光值對比展示在圖1C。
在分選過程中，設(shè)置條件包括熒光強(qiáng)度最高的30%的細(xì)胞，并且大于12微米，圓度為0.6～1，以排除不能增殖的和不規(guī)則形狀的細(xì)胞。隨后將分選的細(xì)胞置于96孔板中培養(yǎng)（1個細(xì)胞/孔），20天后通過ForteBio定量分析抗Her2 mAb的表達(dá)情況。經(jīng)VHH-1-GFP分選的亞克隆的平均mAb濃度為15.75 mg/L，最高值為28 mg/L，而經(jīng)AF488共軛山羊抗體篩選的亞克隆的平均值為9.14 mg/L，最高值為17.8 mg/L（圖2）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了VHH-1-GFP可用于流式細(xì)胞儀分選，并有效富集高mAb表達(dá)的CHO細(xì)胞。
瑞諾生物提供Rhinogen?重組抗人IgG（Fc）納米抗體- Fluorescein標(biāo)簽，可特異性識別4種人IgG并具有超高親和力，其中Fluorescein標(biāo)簽可由480nm激光激發(fā)，并在510nm發(fā)射?？捎糜诹魇郊?xì)胞分析（Flow）、免疫熒光（IF）、免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）、免疫組化（IHC）等，特別的可配合流式細(xì)胞分選儀、ClonePix? Systems、F.sight?單細(xì)胞篩選儀用于高表達(dá)IgG克隆篩選，在短時間得到大量高表達(dá)克隆。
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