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目的    建立氫氧化鋁佐劑細(xì)菌內(nèi)毒素的重組C因子檢測方法。

方法   參照中國藥典2020年版四部載錄的重組C因子法，通過靈敏度試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證、稀釋法排除干擾、重復(fù)試驗(yàn)，建立氫氧化鋁佐劑的內(nèi)毒素定量檢測方法。

結(jié)果   通過靈敏度試驗(yàn)，篩選出合適的96孔反應(yīng)微板。標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證試驗(yàn)檢測3批試劑，決定系數(shù)均大于0.980。干擾試驗(yàn)中通過稀釋法排除氫氧化鋁對檢測的干擾。對Alhydrogel? 2％、國藥中生生物技術(shù)研究院生產(chǎn)的氫氧化鋁佐劑進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，未檢測到內(nèi)毒素。檢測這兩個(gè)生產(chǎn)廠家的氫氧化鋁佐劑共13批，回收率均在50％～200％范圍內(nèi)，結(jié)果符合中國藥典規(guī)定。

結(jié)論  重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑具有良好的靈敏度、可靠性、重復(fù)性及抗干擾能力，可應(yīng)用于氫氧化鋁佐劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。

      鋁佐劑已廣泛應(yīng)用于人用疫苗80余年，其安全性和有效性均得到了充分驗(yàn)證。Alhydrogel?佐劑是目前國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鋁佐劑[1-3]。中國藥典2020年版四部（藥典四部）對于氫氧化鋁佐劑內(nèi)毒素含量有明確要求，應(yīng)小于每毫克鋁5 內(nèi)毒素單位（endotoxin unit，EU）[4]。各種鋁佐劑和含鋁佐劑疫苗的制備過程不一，鋁離子及其膠體特性對一些檢測方法有干擾，因此在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的過程中需進(jìn)行方法適用性考察[5-7]。

      C因子為激活鱟試劑凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)的第1個(gè)組分，可選擇性識(shí)別細(xì)菌內(nèi)毒素。重組C因子法采用人工表達(dá)的C因子，無需鱟原料，同時(shí)具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、高通量、可定量檢測等優(yōu)點(diǎn)[8-10]，2013、2020、2021年先后被美國、中國、歐洲藥品監(jiān)管部門接受為內(nèi)毒素檢查法[4, 11-12]。本研究采用國產(chǎn)試劑，探索重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑細(xì)菌內(nèi)毒素方法及干擾情況，建立檢測方法。

      進(jìn)口Alhydrogel? 2％氫氧化鋁佐劑購自丹麥Brenntag Biosector公司，鋁含量10 mg/ml，尚未建立鱟試劑凝膠檢測內(nèi)毒素方法，生產(chǎn)廠家采用的熱原檢查法為家兔法，參照藥典四部要求，合格標(biāo)準(zhǔn)為50 EU/ml；國產(chǎn)氫氧化鋁佐劑由國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司第六研究室提供，經(jīng)鱟試劑凝膠法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素合格，參照藥典四部要求，合格標(biāo)準(zhǔn)為3 EU/ml。

      3批重組C因子內(nèi)毒素檢測試劑盒購自蘇州瑞安生物科技有限公司，批號(hào)分別為RF010201203、RF010210402、RF010210403。

        用內(nèi)毒素檢查用水將試劑盒中內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，加入微板，100 μl/孔，每個(gè)濃度設(shè)2~6個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育15 min。將熒光底物、緩沖液、重組C 因子酶按5∶4∶1混合，加入微板中，100 μl/孔，振蕩15 s，37 ℃孵育，于0和1 h時(shí)用熒光微板檢測系統(tǒng)讀數(shù)。計(jì)算每孔在0和1 h時(shí)相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）之差的對數(shù)lgΔRFU。

1.4.1 靈敏度驗(yàn)證    配制濃度為0.5 EU/ml的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。設(shè)置儀器參數(shù)：激發(fā)、發(fā)射波長380 nm和440 nm，溫度37 ℃，2次讀數(shù)之間間隔1 h，光學(xué)位置為頂部，儀器增益值為自動(dòng)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：lgΔRFU均值在3.5~4.0。選取3種96孔反應(yīng)微板進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證    采用3批內(nèi)毒素檢測試劑盒，分別配制濃度為5×10^-3~5×10⁰ EU/ml的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，陰性對照為內(nèi)毒素檢查用水。每個(gè)濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液和陰性對照做3個(gè)復(fù)孔。完成后按公式計(jì)算每孔的lgΔRFU，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與陰性對照孔的 ΔRFU 之差為凈 ΔRFU值，以凈 ΔRFU對數(shù)對內(nèi)毒素濃度對數(shù)進(jìn)行線性擬合，標(biāo)準(zhǔn)曲線精密度要求：決定系數(shù)（R²）應(yīng)大于等于0.980。

1.4.3 干擾試驗(yàn)    每次試驗(yàn)均按1.4.2方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在供試品陽性對照中添加0.5 EU/ml的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。供試品采用不同稀釋濃度以排除干擾。每個(gè)試驗(yàn)做2復(fù)孔，進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。計(jì)算樣品及加標(biāo)樣品的內(nèi)毒素濃度，按下列公式計(jì)算加標(biāo)回收率，若加標(biāo)回收率在 50%~200%之間則認(rèn)為樣品對檢測無干擾，結(jié)果可靠。

1.4.4 重復(fù)試驗(yàn)    按1.4.3方法將進(jìn)口、國產(chǎn)氫氧化鋁佐劑分別稀釋4 000、400倍，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品及加標(biāo)樣品的內(nèi)毒素濃度、加標(biāo)回收率。

1.4.5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測    采用進(jìn)口、國產(chǎn)氫氧化鋁佐劑共13批，均按1.4.4項(xiàng)方法分別稀釋4 000、400倍，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品及加標(biāo)樣品的內(nèi)毒素濃度、加標(biāo)回收率。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2≥0.980、樣品加標(biāo)回收率在 50%~200%之間、內(nèi)毒素濃度分別低于50和3 EU/ml時(shí)，判定內(nèi)毒素檢測合格。

     貨號(hào)966、6005181的微板lgΔRFU值分別為2.63、3.19，不滿足靈敏度驗(yàn)證的要求（3.5~4.0）。貨號(hào)136101的微板lgΔRFU值為3.58，可用于檢測。

       取陰性對照、4個(gè)濃度工作標(biāo)準(zhǔn)品做3復(fù)孔，內(nèi)毒素濃度在5×10^-3~5×10⁰  EU/ml時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線R²為0.999，線性良好（圖1）。    

        對3批重組Ｃ因子試劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證，R²分別為0.999、0.982、0.996，均大于等于0.980（圖2）。結(jié)果證明試劑、試驗(yàn)條件可靠。

        重組C因子法26次試驗(yàn)R²均在0.980以上，均值為0.996，具有良好的精密度。

      進(jìn)口氫氧化鋁佐劑在10、100、1 000、2 000倍稀釋后，加標(biāo)回收率為0.0%、0.0%、2.2%、7.6%，表明存在抑制作用，即存在干擾。在4 000倍稀釋后，加標(biāo)回收率為64.4%，排除了干擾。國產(chǎn)氫氧化鋁佐劑在10、100、200倍稀釋后，加標(biāo)回收率為0.0%、0.0%、23.6%，表明存在抑制作用，即存在干擾。在400倍稀釋后，加標(biāo)回收率為55.0%，排除了干擾（表1）。

       進(jìn)口、國產(chǎn)氫氧化鋁佐劑分別稀釋4 000、400倍，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性符合要求；樣品加標(biāo)回收率均在50％～200％范圍內(nèi)，無干擾；內(nèi)毒素定量檢測結(jié)果低于限值，根據(jù)藥典四部可判定合格。結(jié)果重復(fù)性良好（表2）。

      內(nèi)毒素檢測結(jié)果見表3，檢測2個(gè)廠家的氫氧化鋁共13批，標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性符合要求，樣品的加標(biāo)回收率均在50％～200％范圍內(nèi)，無干擾，細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測值均低于合格標(biāo)準(zhǔn)，可判定合格，符合藥典四部規(guī)定。表明所建立的排除干擾方法可用于重組C因子法檢測，且重復(fù)、適用性良好，可用于氫氧化鋁佐劑日常質(zhì)量控制。

       本試驗(yàn)根據(jù)藥典四部“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則” [9]，并參照相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，對重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑內(nèi)毒素進(jìn)行方法適用性研究，結(jié)果顯示靈敏度、可靠性、精密度、重復(fù)性良好。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用于熒光檢測的96孔反應(yīng)微板除滿足無菌、無熱原等要求外，還需進(jìn)行驗(yàn)證篩選。歐洲藥典中要求對每批重組Ｃ因子試劑均需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證，其亦是各國藥典中規(guī)定的方法轉(zhuǎn)移驗(yàn)證，用以證明該實(shí)驗(yàn)室可以操作重組Ｃ因子法[9-11]。按藥典四部要求，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2應(yīng)大于等于0.980，驗(yàn)證3批重組Ｃ因子試劑的R2均大于0.980，證明試劑、試驗(yàn)條件可靠。

       重組Ｃ因子法因采用了熒光反應(yīng)，不能直接使用其他方法干擾試驗(yàn)的結(jié)論，加之生物制品的成分復(fù)雜，不同品種的供試品必須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。通過重組C因子法檢測不同稀釋倍數(shù)的氫氧化鋁佐劑，排除了氫氧化鋁自身性質(zhì)引起的干擾，并通過重復(fù)試驗(yàn)及對13批氫氧化鋁佐劑的檢測建立具體檢測方法，解決了氫氧化鋁佐劑采用鱟試劑凝膠法檢測有干擾的問題^[15]。

      重組C因子法采用儀器定量檢測，每次試驗(yàn)均可定量觀察到樣品的干擾或增強(qiáng)情況，只需對3批新產(chǎn)品進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果即可快速建立方法。其高通量、快速的特性也更適用于檢測生物制品成分復(fù)雜的原料、半成品、成品，滿足研發(fā)、生產(chǎn)疫苗快速、準(zhǔn)確的需求。本研究表明重組C因子法適用于氫氧化鋁佐劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)（略）

龐宇  王菲  章孟學(xué)  馮帆  劉愛平  孫成金

國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司質(zhì)量檢定室，北京  101111

通信作者：孫成金，

Email: schj1979@163.com

引用本文：龐宇，王菲，章孟學(xué)，等. 重組C因子法檢測氫氧化鋁佐劑細(xì)菌內(nèi)毒素的適用性 [J]. 國際生物制品學(xué)雜志, 2022, 45(5): 257-260.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220210-00011