細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（LPS）和微量蛋白的復(fù)合物，它不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。其化學(xué)成分主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成，分子量因來源不同從幾千到幾萬，締合物可達(dá)400,000-1,000,000。
內(nèi)毒素對機(jī)體可產(chǎn)生致病作用。它作為外源性致熱原作用于細(xì)胞，使之釋放內(nèi)源性致熱原，引起發(fā)熱。并可激活血管活性物質(zhì)的釋放，使末梢血管擴(kuò)張，通透性增高，靜脈回流減少，心排血量減低，導(dǎo)致低血壓并發(fā)休克，或因組織供血不足缺氧，導(dǎo)致代謝性酸中毒。另一方面，它可發(fā)揮諸多對機(jī)體有益的生物學(xué)活性。適量的內(nèi)毒素可增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫的作用，能夠抗感染、抗輻射，并能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的活力，并具有使腫瘤壞死消退的活性。
現(xiàn)有細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法包括家兔熱原試驗法、鱟試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯(lián)免疫法等。《中華人民共和國藥典》（2020版）規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測可采用鱟試劑檢測法，為適應(yīng)特殊品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的需要，或減少鱟試劑的使用量，可采用重組C因子法或微量凝膠法等。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢測受多種因素影響，包括但不限于PH、溫度、螯合劑等。只有很少的樣品沒有干擾可直接進(jìn)行檢測，但是大約90%以上的干擾因素，可通過簡單的處理，如不同程度的樣品稀釋消除干擾。
內(nèi)毒素檢測的反應(yīng)是一個復(fù)雜的酶促反應(yīng)，因此其反應(yīng)的介質(zhì)要求有合適的pH，最佳pH范圍為6-8。為保證反應(yīng)時合適的pH，檢測試劑必須具有一定的pH 緩沖能力。但有些檢品本身要求在酸性或堿性的介質(zhì)中保存，且自身也具有一定的pH緩沖能力，對這類檢品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，檢測試劑的pH 緩沖能力就不足以使反應(yīng)介質(zhì)的pH緩沖到最佳范圍，會使反應(yīng)受到干擾，通常表現(xiàn)為抑制作用。
內(nèi)毒素是一個具有親水、疏水兩個區(qū)域的兩性分子，這種結(jié)構(gòu)使內(nèi)毒素分子間或內(nèi)毒素分子與檢品中成分結(jié)合形成微室，內(nèi)毒素的分散性是由脂質(zhì)A形成高分子聚合物的功能和多糖與陽離子靜電引力決定的，當(dāng)內(nèi)毒素分子的聚集增加，內(nèi)毒素的反應(yīng)性和熱原性都顯著下降，通常檢品中離子強(qiáng)度的較大提高會引起內(nèi)毒素的聚集和回收率降低。
內(nèi)毒素稀釋液貯存一段時間后會被破壞而失活，即使經(jīng)充分的旋渦混合也不能恢復(fù)，其中可能有多種干擾因素，但容器效應(yīng)是其中一個因素。容器效應(yīng)與接內(nèi)毒素稀釋液的容器材質(zhì)有關(guān)，主要表現(xiàn)管壁對內(nèi)毒素的吸附，聚丙烯材質(zhì)還會對脂多糖復(fù)合物產(chǎn)生深度抑制。另外稀釋管洗滌后殘留的洗滌劑，也會形成微室，影響內(nèi)毒素的分散。
二價離子對內(nèi)毒素分散起著重要作用，Ca2＋、Mg2＋離子濃度的不適宜會引起抑制或增強(qiáng)反應(yīng)。許多原因都會引起二價離子的不充足，從而抑制內(nèi)毒素檢測試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的能力。
內(nèi)毒素檢測是基于一系列絲氨酸蛋白酶的酶促放大作用產(chǎn)生的，絲氨酸蛋白酶可以被氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑或?qū)Ｒ皇Щ顒┧鶞缁?，這些都會引起抑制，乙醇和苯酚對蛋白質(zhì)有變性作用，因而要限制其在樣品中的含量。
鱟試劑與內(nèi)毒素和葡聚糖可以共同反應(yīng)，且存在內(nèi)毒素與葡聚糖共同作用時，鱟試劑的凝膠反應(yīng)比對單一物質(zhì)作用更迅速、更劇烈。因此可采用重組C因子法進(jìn)行檢測，規(guī)避葡聚糖引起的干擾。
1、加熱滅活
對由于蛋白質(zhì)或酶的修飾而表現(xiàn)的抑制作用或?qū)е聝?nèi)毒素檢測試劑變化的藥物本身是蛋白酶類，可通過加熱滅活處理來消除干擾，或使用超濾薄膜法去除。
可以通過稀釋樣品后避免樣品對于內(nèi)毒素檢測反應(yīng)的干擾，應(yīng)注意，有些樣品若堿性較強(qiáng)，單純的稀釋是不能排除干擾的，必須經(jīng)過調(diào)節(jié)樣品的pH后再稀釋，才能排除干擾。
內(nèi)毒素稀釋管應(yīng)該是高質(zhì)量硼硅酸鹽玻璃材質(zhì)，以避免內(nèi)毒素吸附于試管壁。不可使用塑料用具，因其伴隨很多未知的干擾因素。同時避免使用聚丙烯試管，因為由聚丙烯材料制成的試管對內(nèi)毒素的吸附也被公認(rèn)為是干擾內(nèi)毒素檢查方法的因素之一。
通常采用三種方法調(diào)節(jié)內(nèi)毒素待檢樣品的pH。①使用高靈敏度的檢測試劑，使得檢品的最大稀釋倍數(shù)（MVD）增大，從而減弱或消除檢品的pH因素對檢查的干擾。②用緩沖液制備樣品稀釋液，使檢品的pH達(dá)到適合反應(yīng)的范圍。③用酸、堿或緩沖液來調(diào)節(jié)pH。
最好的消除因絡(luò)合作用而導(dǎo)致離子不足的方法是計算二價離子需要量，然后補(bǔ)充等摩爾無熱原的二價離子鹽。但常用的方法是通過稀釋來消除絡(luò)合作用。
重組C因子法是傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的一種改良方法, 具有細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的全部優(yōu)點。與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法比較, 還克服了使用動物來源材料這一缺點, 實驗材料為重組產(chǎn)生, 不受鱟資源限制；并且具有更強(qiáng)的抗干擾能力和專屬性。重組C因子是由東方鱟或者美洲鱟的基因克隆而成，具有與C因子一樣的生理活性。其原理是使用單一的蛋白質(zhì)C因子作為活性成分參與反應(yīng)，被內(nèi)毒素活化的C因子將人工合成的三肽鏈熒光底物裂解，產(chǎn)生熒光復(fù)合物在380nm～460nm檢測，通過定量檢測熒光復(fù)合物來量化細(xì)菌內(nèi)毒素。其優(yōu)點是因為沒有B因子的存在，從而有效地避免了因G因子的旁路干擾而產(chǎn)生的假陽性。
FDA在2012年發(fā)布的“內(nèi)毒素與熱源檢測應(yīng)用指導(dǎo)原則-問與答”的“5.1有關(guān)替代方法”中明確重組C因子法按USP30-NF25<1225>驗證后，參照USP30-NF25<85>“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行實驗，可用于產(chǎn)品申報，在產(chǎn)品放行中可以使用該方法來控制內(nèi)毒素污染。并于2018年9月批準(zhǔn)重組C因子法用于Eli Lilly的偏頭痛藥品Galcanezumab的最終產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測及產(chǎn)品放行。
多家國際知名藥企針對基于重組C因子的檢查方法與基于鱟試劑的檢查方法的比較，其結(jié)果表明兩種方法都足以用于測試和發(fā)布多種產(chǎn)品，特別是對于含有葡聚糖的產(chǎn)品重組C因子的檢查方法更為合適，在按照藥典要求得到充分驗證后，可以考慮將其作為合適的替代方法，用于檢測藥品生產(chǎn)過程中的內(nèi)毒素。
目前重組C因子法已陸續(xù)被歐洲藥典和中國藥典收錄，作為不依賴動物鱟來源的可替代的內(nèi)毒素檢測方法將是大勢所趨。
參考文獻(xiàn)
[1]何進(jìn),高軍,陳金旺.凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾因素及消除[J].中國藥師,2010,13(02):284-287.
[2]王婭寧,高龍.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代鹽化工,2019,46(05):59-60.
[3]裴宇盛,蔡彤,高華.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查新方法進(jìn)展[J].藥物分析雜志,2014,34(03):392-395.
[4]王宏衛(wèi).熱原檢測的新時代[J].國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊,2002,(03):110-112.[5]Marine Marius,Frédéric Vacher,Thierry Bonnevay. Comparison of Limulus Amoebocyte Lysate and Recombinant Factor C Assays for Endotoxin Detection in Four Human Vaccines with Complex Matrices. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology July 2020, 74 (4) 394-407.
[6]Jay Bolden, Chris Knutsen, Jack Levin, Catherine Milne, Tina Morris, Ned Mozier, Ingo Spreitzer and Friedrich von Wintzingerode. Currently Available Recombinant Alternatives to Horseshoe Crab Blood Lysates: Are They Comparable for the Detection of Environmental Bacterial Endotoxins? A Review. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology September 2020, 74 (5) 602-611.