臨床輸液反應以熱原反應危害最大，發(fā)生率最高。內(nèi)毒素（即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS）注射即使是pg級別的痕量LPS也會導致病人嚴重的熱原反應，引起人體發(fā)熱、休克甚至死亡。因此，靈敏可靠的內(nèi)毒素分析技術是非常必須的。
目前細菌內(nèi)毒素檢查主要依賴于鱟試劑，可分為凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。
內(nèi)毒素的低回收率現(xiàn)象（Low Endotoxin Recovery,LER）是當前經(jīng)常討論的話題。內(nèi)毒素低回收率是指對已經(jīng)添加細菌內(nèi)毒素標準品的生物制藥產(chǎn)品采用藥典規(guī)定方法進行細菌內(nèi)毒素檢查時加標內(nèi)毒素檢出失敗的現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象通常表現(xiàn)為回收率過低，內(nèi)毒素被掩蔽。如果“內(nèi)毒素掩蔽”發(fā)生，意味著該內(nèi)毒素的活性形式（超分子結構）發(fā)生了變化，從而檢測到的值要比實際低。因加入細菌內(nèi)毒素標準品的藥品內(nèi)毒素回收失敗，生產(chǎn)過程中被內(nèi)毒素污染的含熱原產(chǎn)品會因內(nèi)毒素不能被檢出而被放行，導致含熱原的產(chǎn)品因用于商業(yè)用途而被患者使用的風險仍舊存在。
2013年，F(xiàn)DA開始要求生物制品上市申請（Biologicslicensing applications，BLA）的申請人須提交在藥品中加入內(nèi)毒素標準品后，使用USP規(guī)定的細菌內(nèi)毒素檢查方法可以檢出藥品中預加入的細菌內(nèi)毒素。在BLAs中關于內(nèi)毒素加標試驗及內(nèi)毒素保持時間的研究遇到了很大難點，這推動FDA需要獲取更多信息或額外的研究來說明。但是不同公司和不同研究的spike/hold study存在明顯的差異。
加標樣品的細菌內(nèi)毒素的檢出受樣品的制備方法影響（包括預處理及渦旋時間等），同時細菌內(nèi)毒素標準品的類型、細菌內(nèi)毒素標準品的加入量、保持時間、被加標樣品的溫度、內(nèi)毒素回收率的計算方式、檢查的執(zhí)行等均可引起測試結果的明顯差異，這增加了對結果進行比較和分析難度。等電點（Isoelectric points，pI)大于8或具有正電結構的特定蛋白質(zhì)會束縛加入樣品中的內(nèi)毒素標準品從而引起LER。
內(nèi)毒素掩蔽是時間依賴性的，這意味著如果掩蔽發(fā)生，內(nèi)毒素的回收率隨時間降低。要降低低回收率現(xiàn)象，可以選擇具有足夠高濃度的樣品，然后進行稀釋從而排除或減少干擾。
此外，除了回收率低這一現(xiàn)象，內(nèi)毒素檢測中也存在假陽性這一問題。這主要是因為除了內(nèi)毒素，內(nèi)毒素檢測所用的鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應，產(chǎn)生假陽性結果。科學研究表明，含有高濃度蛋白質(zhì)和聚山梨酯等非離子型表面活性劑的生物制劑結合使用后，往往會改變內(nèi)毒素分析物的聚集態(tài)，以至于內(nèi)毒素的檢測存在問題。
鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應。2021年2月5日，《國家重點保護野生動物名錄》將我國分布的鱟科動物（中國鱟、圓尾蝎鱟）升級為國家二級保護動物。這無疑對依賴鱟試劑的內(nèi)毒素檢測造成了影響。
2020版中國藥典《9251細菌內(nèi)毒素檢查法應用指導原則》提出，可使用重組C因子法進行內(nèi)毒素檢測。
重組C因子（rFC）內(nèi)毒素檢測是一種不依賴于動物源性成分、靈敏度高、特異性高、可穩(wěn)定且持續(xù)提供的替代鱟試劑的內(nèi)毒素測定方法。
C因子是傳統(tǒng)鱟試劑中對細菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性地識別內(nèi)毒素。重組C因子利用基因重組技術表達的內(nèi)毒素特異性酶，被活化后可直接與熒光底物作用，產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成正比的熒光信號，從而實現(xiàn)定量。相對于傳統(tǒng)鱟試劑，重組C因子法可以為我們帶來以下優(yōu)點：
1、保護鱟資源
rFC方法無動物源，保護了鱟資源，也符合現(xiàn)在3R保護理論，即對使用實驗動物的實驗應替代、減少、優(yōu)化。
2、避免β-葡聚糖的干擾
傳統(tǒng)鱟試劑檢測方法由于存在旁路反應（鱟試劑中的G因子在β-葡聚糖存在下也可以引起反應），會造成假陽性。而重組C因子方法從原理上就避免了這種干擾。
3、標準化
鱟血是個復雜的成分，不同個體、不同時間、地點采集的鱟血都會有所不同，這就造成了鱟試劑存在一定的批次間波動。而重組C因子方法由于其可控的生產(chǎn)工藝，可以保證其批間穩(wěn)定性。使企業(yè)實現(xiàn)標準化檢測。
4、持續(xù)穩(wěn)定供給
對于內(nèi)毒素檢測的需求在急劇增加，但是鱟資源卻在急劇緊縮。這種供需關系也為鱟試劑的使用帶來的很大風險。重組C因子法基于其可無限重復的生產(chǎn)工藝，可以保證持續(xù)穩(wěn)定的供給。
2018年，F(xiàn)DA批準了基于rFC試劑進行內(nèi)毒素檢測的藥物。這為rFC檢測方法的廣泛采用打開了大門。作為一種合成試劑，rFC可以替代來源于鱟血液的美洲鱟試劑（LAL）和東方鱟試劑（TAL）用于內(nèi)毒素檢測。rFC試劑的主要優(yōu)點是提高了一致性和可持續(xù)性。變異是所有動物源性產(chǎn)品的共同特征，合成的一致性可以使生產(chǎn)和檢測過程更容易控制，并且由于可以無限制地的生產(chǎn)rFC，從而更具可持續(xù)性。
參考文獻
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